【要闻】蛋白质的结构和功能

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构成蛋白质的20种氨基酸的分类、分类依据及一些特殊氨基酸的分类；

氨基酸理化性质、肽形成反应及体内重要的生物活性肽；

蛋白质的分类和分子结构

蛋白质结构(包括初级结构和空之间的结构)与功能的关系

蛋白质理化性质、分离纯化的基本做法及其原理

蛋白质一级结构的测定(即多肽链中氨基酸序列的分解)和空之间的结构测定。

要点:

氨基酸的分类和理化性质，蛋白质的初级和空之间的结构和功能的关系，分离纯化蛋白质的原理和做法。

难点:

蛋白质一级结构的测定也是很多研究者多年来消费的课题，我们只是弄清楚它

每一步的基本原理和做法都可以。

基本知识和理论

蛋白质的生物学功能(了解即可)

蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命，生物体的结构越多越复杂，其蛋白质的种类和功能是多方面的

其主要生物学功能如下:

(一)催化剂和调节能力

有些蛋白质是酶，催化生物体内的物质代谢反应。

有些蛋白质是激素，具有胰岛素调节糖代谢、体内信号转导等一定的调节功能。

(二)运输功能

血红蛋白等一些蛋白质是输送氧和二氧化碳的手段，血清白蛋白可以输送自由脂肪酸和胆

红素之类的。

(三)收缩或运动功能

有些蛋白质赋予细胞和器官收缩的能力，可以改变形状和运动。 例如骨骼肌收缩是肌动蛋白和肌动蛋白

白色。

(四)免疫球蛋白等防御功能抵抗外来有害物质，保护机体。

(5)铁蛋白这样的营养和储藏功能可以储藏铁。

(6)结构蛋白

多个蛋白质发挥支撑作用，对韧带中含有弹性蛋白质、具有双向拉伸强度等生物结构赋予强度和保护。

(七)其他功能

如果病毒和噬菌体是核蛋白，病毒就能致病。

二、蛋白质的分子组成

(1)元素组成

构成蛋白质分子的主要元素是碳、氢、氧、氮、硫。 也有含有少量磷和金属元素的。 因为各蛋白质的氮含量平均接近16%，蛋白质是体内的主要含氮物质，可以根据生物样品的氮含量推测蛋白质的大致含量。

(二)氨基酸

氨基酸蛋白质的基本构成单元是自然界中存在的氨基酸在300种以上，但构成人蛋白质的氨基酸只有20种，都是l-α-氨基酸(甘氨酸除外)的左旋氨基酸。 甘氨酸没有手性碳原子(四个不同的原子或相连的碳原子)，因此具有手性碳原子的手性分子很多，手性分子具有旋光活性。 根据那些侧链r的结构和性质，分为以下四类。

1 .非极性疏水性氨基酸:

这种氨基酸的特征是在水中的溶解度比极性氨基酸小。

2极性中性氨基酸:

这种氨基酸的特征是比非极性氨基酸更容易溶解于水，且羧基的数量与氨基的数量相等，因此是中性氨基酸，但羧基的电离能力大，因此实际上具有弱酸性。

3 .酸性氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸。 这两种氨基酸都含有两个羧基，在生理条件下带负电，因此是酸性氨基酸。

4 .碱性氨基酸:赖氨酸、精氨酸和组氨酸。 这样的氨基酸在生理条件下带正电，因此是碱性氨基酸。

你必须记住这20种氨基酸的缩写，特别是三个字母的符号。 另外，这四种氨基酸中有一些特殊的氨基酸，还需要记住它们的独特特征。

芳香族氨基酸:苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分子中含有芳香环

含硫氨基酸:蛋氨酸、半胱氨酸分子中含有含硫元素，蛋氨酸也被称为蛋氨酸。

氨基酸:脯氨酸，其氨基在环中，是氨基酸

支链氨基酸:缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，这三种都含有支链

其中8种氨基酸不能在人体内自行合成，必须从食物中获得，称为必需氨基酸，它们是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、蓖麻毒素、苯丙氨酸、色氨酸。

三、氨基酸的理化性质

(1)两性电离及等电点

氨基酸分子中含有碱性的α-氨基和酸性的α-羧基，与酸和碱性物质结合形成盐，因此是两性电解质。 在某个ph的溶液中氨基酸解离成阳离子和阴离子的倾向与程度相等，成为兼容性离子，成为电中性，此时的溶液ph被称为该氨基酸的等电点( pi )。 这里有等电点的计算问题。

1侧链r是非极性基团或极性但难以解离的氨基酸的等电点主要由α氨基和α羧基的解离常数的负对数pk1、pk2决定，pi=1/2(pk1+pk2 )

如果2侧链基可以解离，则由α氨基、α羧基及r基解离而共同决定，写出电离式，取其兼顾离子两边的pk值的平均值即可。 其电离式为蓖麻毒素；

由电离式可知，其兼容性离子两边的pk值分别为pkα-nh3+和pkε-nh3+，与α-羧基无关，pi=1/2 (8.95+10.537)=9.74

(2)紫外吸收的性质

色氨酸、酪氨酸在波长280nm附近有最大的紫外线吸收峰，有很多蛋白质

由于含有这样氨基酸，因此测定了蛋白质溶液的280nm光吸收

收值是分解溶液中蛋白质含量的迅速简便的方法。

(3)茚满酮反应:氨基酸+茚满酮水合物→茚满酮+氨还原，茚满酮+氨+茚满酮→蓝紫色化合物还原

因为该化合物的最大吸收峰是570nm波长，该吸收峰的大小与氨基酸释放的氨量成比例，所以可以作为氨基酸的定量分解方法使用。

四、肽

肽键。

双分子氨基酸可以从一分子中含有的氨基和另一分子中含有的羧基中除去一分子的水合成二肽，两个氨基酸之间产生的酰胺键被称为肽键，具有不典型的双键性质。 10个以内的氨基酸缩合而成的肽称为寡肽，与氨基酸相连而构成多肽的肽正在增加。 pr是具有更大分子量的多肽链，但多肽和pr不容易在分子量上形成明确的边界，实用上只有一个习性区分。 肽链中的氨基酸分子因脱水缩合而基团不完全，被称为氨基酸残基。 多肽链中的自由氨基末端称为n末端，自由羧基末端称为c末端，命名从n端到c端。

(二)生物活性肽

1 .谷胱甘肽

由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的三肽。 最初的肽键比较特殊，由谷氨酸γ-羧基和半胱氨酸的氨基组成。 分子中半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基。 该巯基具有还原性，必须记住谷胱甘肽的生理作用:①保护蛋白质或酶作为体内重要的还原剂，使其处于活性状态②还原细胞内产生的h2O2，使其巯基具有多核特性，

2 .多肽类激素及神经肽。 体内有多种激素属寡肽和多肽，如催产素、肾上腺皮质刺激激素、甲状腺刺激激素等。 神经肽是脑内啡肽、β内啡肽等在神经传导过程中起信号传导作用的肽类。

五公关的分类

pr的分类分为单纯pr、结合pr，后者除了aa以外，还包括非pr部分即补缺基，大部分补缺基通过共价键与pr部分相连，根据形状分为纤维pr和球状pr

六、蛋白质的分子结构

(构成各级结构的化学键需要注意)

可以分为1级、2级、3级、4级结构四个层次，后三个统称为高级结构或空间结构。 蛋白质空间构象复盖了蛋白质分子中各个原子的三维空之间的相对位置，并不是所有的pr都具有四级结构，而是由两条以上多肽链组成的pr具有四级结构。

(1)蛋白质的初级结构

蛋白质一级结构是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。 主要的化学键是肽键和二硫化物键。 一级结构是蛋白质空之间结构和特异生物学功能的基础。 氨基酸序列顺序的差异意味着从多肽锁骨延伸的侧链r基的性质和顺序对每个蛋白质都是独特的。 因为根据r基的大小带电的电荷数不同，对水的亲和力不同，所以蛋白质的空之间的构象也不同。

(2)蛋白质的二级结构

蛋白质二级结构是指蛋白质分子中某段肽链的局部空间结构，即该段肽链的主链骨架原子的相对空间位置，与氨基酸残基侧链构象无关。 维持二级结构的化学键以氢键为第一。 二次结构的第一形态是α螺旋结构、β一折、β角、不规则的卷曲。

肽单位。

参与肽键的6个原子cα1、c、o、n、h、cα2在同一平面上，且cα1、cα2在平面上的位置是变压器结构，这6个原子构成肽单元，其基本结构为

图中a、b键为单键，可以自由旋转，但从这两个单键的自由旋转的立场出发，决定了邻接肽单键

元之间的相对空之间的位置。 其中的肽键在某种程度上具有双键的性质，不能自由旋转。

2.α-螺旋。

多肽链的主链绕中心轴呈规则的螺旋状上升，每3.6残基螺旋旋转1周，各氨基酸残基上升0.15nm，因此螺距为0.54nm。 螺旋的流动是右手螺旋。 α-螺旋各肽键的n-h和第四个肽键的羰氧基形成氢键，氢键的方向与螺旋长轴大致平行，侧链r基露出螺旋外。

3.β-折叠。

多肽链充分延伸，各肽单元以c为旋转点折叠成锯齿状结构，侧链r基交替位于锯齿状结构的上下。 可以从两个以上的肽链或一个肽链内的几个肽段折叠成锯齿状结构。 平行肽段之间由链间肽结合羰基氧和亚氨基氢形成氢键，稳定构象，该氢键方向垂直于折叠的长轴。 两条平行肽链的方向可以相同也可以相反，一条肽链折叠形成的β-折叠多为反式，反式平行比顺式平行更稳定。

4.β-拐角和随机卷曲。 β周转角经常发生在肽链周转180度时的周转角，一般由4个氨基酸残基组成，其第一个残基的羰氧基和第四个残基的氨基氢形成氢键。 β-角的第二个残基多为脯氨酸。 因为其n原子位于环中，形成肽键的n原子没有h，不能形成氢键，所以匝β-角经常发生在蛋白质分子的表面，这与蛋白质的生物学功能有关。 随机卷曲用于解释规律性不明确的部分的肽链结构。

5 .模式。 多个蛋白质分子中，发现两个或三个具有二级结构肽段，在空间相互接近，具有特殊的功能空间结构，可以依次称为。 实际上是超二次结构。 一个模块总是具有其特征性的氨基酸序列，发挥特殊的功能。 常见的α-螺旋-环-α-螺旋结构和锌指结构，前者结合ca2+，后者结合zn2+，α-螺旋能嵌入dna的大槽中。

因为含有这种结构的pr可以与dna和rna结合，所以pr是控制dna转录和pr翻译过程所必需的。 一段肽链氨基酸残基的侧链适合形成α-螺旋或β-折叠，出现对应的2段结构，aa残基带的相同电荷或侧链过大，妨碍2段结构的形成，还有一个分子伴侣的概念，其作用是肽

(3)蛋白质的三级结构

肽键整体中全部氨基酸残基的相对空间的位置，即肽链整体的全部原子的三维空间的配置位置。 三级结构的形成和稳定主要依靠疏水键、盐键、二硫化物键、氢键和范德瓦尔斯力等二级键。 其中疏水耦合是最重要的稳定力。 疏水键是蛋白质分子中疏水基之间的结合力，酸性和碱性氨基酸r基可以带电荷，正负电荷相互吸引形成盐键，氢原子和电子对共享形成的键是氢键。

分子量大的蛋白质的三级结构，在整个肽链中，通常可以分割成紧密折叠的结构域，但实际上结构域也是二级结构和三级结构之间的结构层次，每个结构域起到一定的功能。

(4)蛋白质四级结构

蛋白质的四级结构由具有生物活性的两条以上肽链构成，肽链和肽链之间不是共价键，而是以非共价键维持。 各多肽链有被称为蛋白质亚基的完全三级结构，该蛋白质分子中各亚基的空之间的配置和亚基的接触部位的配置和相互作用被称为蛋白质的四级结构。 在四级结构中，各亚基之间的结合力主要是疏水作用，氢键和离子键也参与了四级结构的维持。 含有四级结构的蛋白质，单独的亚基通常没有生物学功能，只有完善的四级结构才有生物学功能。

七、蛋白质结构与功能的关系

(1)蛋白质的初级结构和功能的关系必须理解三点

1 .一次结构是空间构象和功能的基础，空间构象被破坏的多肽链，只要其肽键不断裂，就可以恢复到原来的三次结构，功能依然存在。

2 .即使是不同物种间的多肽和蛋白质，其一次结构越类似，其空间的构象和功能就越类似。

.物种越接近，其同种蛋白质的初级结构越类似，功能也越类似。

但是，一级结构中的一些氨基酸的作用非常重要，如果蛋白质分子中起重要作用的氨基酸残基缺失或被取代，则会严重影响其空间构象或生理功能，将蛋白质分子变异引起的疾病称为“分子病”

(2)蛋白质空之间结构和功能的关系

蛋白质的多种功能与各种蛋白质固有的空间构象密切相关。 其构象改变，功能活性也随之改变。 以肌红蛋白( mb )和血红蛋白( hb )为例阐述蛋白质空之间的结构和功能关系。

mb和hb都是含有血红素补缺基的蛋白质。 运送氧气的是血红素中的fe2+、fe2+有6个配位结合，其中4个与吡咯环n配位结合，一个与蛋白质的组氨酸残基结合，另一个与氧结合。 血红素和蛋白质的稳定结合主要取决于血红素分子中的两个丙酸侧链与肽链中的氨基酸侧链结合和肽链中的组氨酸残基与血红素中的fe2+结合这两个作用

配位结合。

mb只有一条肽链，所以血红素只结合一分子，氧解离曲线是直角双曲线，hb是由四个子单元组成的四级结构，共计可以结合四分子的氧，氧解离曲线是“S”形曲线，根据曲线的形状特征，hb的第一个子 这种一个亚基与其配体结合后，影响蛋白质分子中另一个亚基与配体结合能力的效果称为协同效果，o2与hb之间是促进作用，称为正协同效果。 之所以具有这样的效果，是因为如果o2没有结合，hb结构就会变密，此时hb和o2的亲和力变小，伴随o2的结合，其亚单元间结合被切断，空间结构会松弛，在这种状态下hb和o2的亲和力会增加。

这种氧分子与hb亚基结合引起亚基构象变化的效果称为变结构效果，该效果将在后面的酶章中详细说明。 肌红蛋白只有一条肽链，没有协同效应。

由此可知，hb和mb的空之间在结构上的差异决定了在体内发挥不同的生理功能。

八、蛋白质的理化性质及其分离纯化

(1)蛋白质的理化性质

pr具有aa的关联性和作为生物高分子的一点独特的性质。

1 .蛋白质的两性电离及等电点，与aa的性质类似，氨基、羧基及侧链的任一基团均可解离。

蛋白质溶液处于某个ph时，蛋白质解离成正负离子的倾向相等，即成为两性离子，净电荷为零，此时溶液的ph被称为蛋白质的等电点。 蛋白质溶液的ph大于等电点时，该蛋白质粒子带有负电荷，相反带有正电荷。 体内各蛋白质的等电点不同，但多数接近ph5.0，因此，在人体体液ph7.4的环境下，很多蛋白质解离为阴离子，带负电。

2 .蛋白质的胶体性

这是pr作为生物高分子具有的性质，可以把蛋白质溶液看作胶体溶液。 pr是作为溶液稳定存在的两大要素:一是蛋白质粒子表面大多是亲水基，吸引水分子，在粒子表面形成水合膜，阻断蛋白质粒子的相互凝聚，防止溶液中蛋白质沉淀析出。 二是蛋白质粒子表面具有相同电荷的粒子彼此相互排斥，难以凝聚沉淀，也作为稳定的粒子发挥作用。 去除蛋白质粒子这两个稳定因子后，蛋白质容易从溶液中沉淀。

3 .蛋白质的变性、沉淀和凝固

这也是pr区别于aa的特有性质。

(1)变性:蛋白质由于某种理化因素，其空之间的结构被破坏，理化性质发生变化，其生物活性丧失，称为变性。 通常认为蛋白质的变性与初级结构的变化没有关系，因此蛋白质的变性较轻时，即使去除变性因素后，也可以恢复原来的构象和功能，称为复原性。 但是，如果其空之间的构象被严重破坏，即使去除变性因素也没有复原性，被称为不可逆变性。 引起变性的因素有各种物理或化学因素。 蛋白质变性后，空间的结构破坏、容易沉淀、粘度增加、失去作为酶的催化活性等性质也受到影响。 变性的蛋白质失去水合膜，疏水侧链露出，但只要该溶液的ph值不等于蛋白酶抑制剂等的电位，蛋白质就不会沉淀，因此变性后，即使蛋白质的溶解度减少，也不一定会沉淀。

医学灭菌是基于蛋白质变性的原理，生物制品的制造和保存必须防止蛋白质变性。

(2)沉淀:蛋白质在溶液中的稳定因素是水合和电荷，因此除去蛋白质表面的水合膜，中和电荷的试剂都可以引起蛋白质的沉淀。 常用的有中性盐、有机溶剂、部分生物碱试剂、大分子酸类和重金属盐类等。

(3)凝固:蛋白质在强酸、强碱的作用下变性后也溶解在强碱或强酸溶液中，将ph调整到等电点后，变性蛋白质立即变成棉状的不溶物，该絮凝物溶解在强酸和强碱中，再加热时絮凝物就会变成比较牢固的凝聚块。 鸡蛋煮熟后本来流动的蛋白就会变成固体，但实际上凝固是蛋白质变性后进一步迅速发展的不可逆结果。

4蛋白的紫外吸收

因为蛋白质分子含有具有共轭双键的酪氨酸色氨酸，这在波长280nm有特征性的吸收峰，类似于aa。 因为在这个波长范围内，蛋白质的吸收光度值与其浓度成比例，可以定量测定蛋白质。

5蛋白质的呈色反应

①茚三酮反应:与氨基酸作用原理相似。

②缩二脲反应:肽键+硫酸铜―稀碱溶液紫色、红色物、氨基酸不出现该反应，因此可以检测蛋白质水解的程度。

(2)蛋白质的分离和纯化

蛋白质的分离纯化过程巧妙地利用蛋白质分子的大小、形状、带电电荷的种类和数量、极性和非极性氨基酸的比例、溶解度、吸附性质以及对其他生物高分子的亲和力的不同，除去杂蛋白质的过程，即蛋白质的物理、化学性质的不同

1 .蛋白质两性电离和等电点分离的方法:

①等电点沉淀法:蛋白质在其等电点的ph附近容易沉淀析出，因此利用各种蛋白质等电点的差异，可以从混合溶液中分离蛋白质。

②电泳:蛋白质以一定的ph带电荷，在电场中可以从电场的一极移动到另一极的现象。 这实际上也利用了蛋白质的分子、形状的不同，游走的速度与蛋白质所具有的电荷的性质、数量、分子、形状有关，因此在具有相同性质的电荷的蛋白质中，带电多，分子小，作为球状分子的蛋白质的游走速度 根据支撑体，可以分为薄膜电泳和凝胶电泳等。 不同的载体，分辨率不同，如正常人血清蛋白电泳可分为5个带，聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为30多个带。 电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，可以看到分离的蛋白质带。 离子交换色谱:在某个特定的ph中，混合蛋白质溶液中各蛋白质所具有的电荷的数量和性质不同，预先在色谱柱中加入离子交换剂，该电荷的性质与蛋白质的电荷的性质相反，蛋白质混合溶液将色谱柱 离子交换体的结合密度不同，带电量小的蛋白质先溶出，溶出液离子强度增加，带电量多的也溶出，可以分离蛋白质。

2利用蛋白质分子量差异进行分离的方法

透析:利用特殊的膜制作透析袋。 这个膜只允许小分子化合物透过，但蛋白质是高分子化合物，所以留在袋内。 因此，如果把袋子放进水里，蛋白质溶液中的小分子杂质就会被除去。 例如，去除盐析后蛋白质中混杂的盐类。 也经常利用这个浓缩蛋白质。 也就是说，如果在袋子外面放入吸收剂，小分子的水就会泄漏，蛋白质溶液会被浓缩。

②分子筛:又称凝胶过滤，是色谱的一种。 柱内填充了有网眼的凝胶粒子。 蛋白质溶液添加到柱中，小分子蛋白质进入孔内，大分子蛋白质不进入孔内直接流出，小分子滞留在孔内流出，从而分离蛋白质。

③超离心:蛋白质胶体溶液与氯化钠等真溶液不同的地方，在蛋白质强的离心场中，在溶液中慢慢沉降，各种蛋白质沉降所需的离心力场不同，因此可以用超离心法分离蛋白质，测定分子量。

.与蛋白质沉淀性质相关的分离方法:

①盐析:硫酸铵、硫酸钠等中性盐可以破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两个因素，因此可以使蛋白质沉淀。 由于蛋白质分子粒径不同，亲水度不同，因此盐析所需的盐浓度不同，分离蛋白质。 例如，用硫酸铵分离白蛋白和球蛋白，在半饱和硫酸铵溶液中，球蛋白从混合溶液中沉淀析出除去，白蛋白在饱和硫酸铵中沉淀。 盐析的优点是不使蛋白质变性。

②丙酮沉淀:丙酮可溶于水，因此可以与蛋白质竞争破坏水合膜，沉淀析出蛋白质，在ph值和离子强度合适的情况下更好，但丙酮会使蛋白质变性，因此在低温下迅速分离，使用其他有机溶剂。

③重金属盐沉淀:由于带正电荷，可以与蛋白质负离子结合形成不溶性蛋白盐沉淀，利用这一性质可以用大量白蛋白救治重金属盐中毒者。

(3)多肽链中氨基酸序列的分解

第一步和原理如下。

1纯化蛋白:用于序列分解的蛋白质应呈现分子大小均匀、电旅行具有一定纯度的样品。

2分解蛋白质的氨基酸组成:用酸、碱等水解蛋白质肽链制成游离氨基酸，用电泳、色谱等分离、鉴定所有游离氨基酸的种类和含量，现在用氨基酸自动分解器可以迅速测定。

3、测定肽链中n末端和c末端是什么样的氨基酸； 蛋白质由2条以上肽链组成时，也可以通过末端氨基酸的测定来估计蛋白质中的肽链数。

①n末端氨基酸的测定:二硝基苯、丹磺酰氯均与末端氨基反应，用盐酸等水解肽链，水解带有二硝基氟苯或丹磺酰氯的氨基酸，从而生成什么样的氨基酸

②c端氨基酸测定:用相应的羧肽酶水解c端氨基酸，各种羧肽酸水解氨基酸酶的特异性不同，因此可以鉴定c端氨基酸。

4 .打开链间、链内的二硫键，会阻碍蛋白水解溶剂的作用，经常使用巯基化合物还原法。 5 .选择合适的酶或化学试剂水解肽链部分，制作适合序列分解的肽片段。 常用的方法是①胰蛋白酶法:水解赖氨酸或精氨酸的羧基形成的肽键，因此如果蛋白质分子中有4个精氨酸或赖氨酸残基，就可以得到5个肽片段。

②胰蛋白酶法:水解芳香族氨基酸羧基侧的肽键

③溴化氰法:水解蛋氨酸羧基侧的肽键。

6 .测定各肽片段氨基酸序列顺序:

通常使用edman分解法。

因为pitc (异硫氰酸酯)只与n末端氨基酸起作用，所以用冰冷的稀酸水解该末端残基，鉴定氨基酸衍生物的种类，为了使残留肽片段的n末端继续与pitc反应，依次鉴定氨基酸的排列顺序。

7 .多肽链用两种方法分别分解成一些肽片段，测定各方法中各肽片段的氨基酸序列，肽片段的叠加法明确肽链整体的氨基酸序列，用两种方法叠加肽标志

8 .二硫化物结合位置的明确化:

电泳法可以以分解二硫键的肽片段和不分解二硫键的带为对象确定二硫键的位置。

由此，测定了完善蛋白质分子的一级结构。

(四)蛋白质空之间的结构测定

常用的方法是x射线晶体衍射法和二维核磁共振技术，也可以根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构。

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来源：简阳新闻