【要闻】重组DNA

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试验点:

dna克隆的概念、限制性内切酶的定义及其优点、基因载体的种类、基因组dna库和cdna库的概念

重组dna技术的基本过程，目的基因的获得方法，外源基因和载体的连接方法，重组dna分子导入受体菌的方法，重组体的筛选方法。

目的基因表达系统的种类及其优势。

要点:

限制酶的作用优势、基因载体种类、重组dna技术的基本环节、目的基因的获得方法、外源基因与载体的连接方法、重组dna导入受体菌的方法、重组体的筛选方法、原核与真核表达系统的优缺点比较

难点:

一、重组dna技术的基本过程、基因载体的种类、原核和真核表达系统的优缺点比较。 自然界基因转移的方法:接合作用、转化及传递作用、易位重组有两种类型。 即位置特异性重组和同源重组。

重构dna技术相关概念

1克隆和克隆

克隆是同一副本或副本的集合。 获取相同副本的过程称为克隆。 为了某个研究目的，从许多不同的分子集团中分离出来的某个兴趣分子，通过无性繁殖(扩增)生成的许多相同分子的集合是分子克隆。

2dna克隆

dna克隆应用酶学方法，在体外将各种来源的遗传物质和载体dna结合成具有自我复制能力的dna分子―复制子，然后转化或转染宿主细胞，筛选含有目标基因的转化子细胞。

3工具酶

在重组dna技术中，基因操作经常需要基本的工具酶。

总结: dna重组技术常用的工具酶

(1)限制性酶:识别特异序列，切断dna

(2)dna连接酶:在dna中相邻的5 '磷酸基和3 '羟基间形成磷酸二酯键，封锁dna的切口，连接dna片段

(3)dna聚合酶I:a .合成双链cdna中的第二链。 

b .缺口平移制作探针。 

DNA序列分析。 

d.3 '填补末端。

(4)taq酶催化pcr反应，聚合dna

(5)逆转录酶a .合成cdna。 b .代替DNA聚合酶I进行填补、标记或DNA序列的分解

(6)多核苷酸激酶催化DNA5'羟基末端的磷酸化或标记探针

(7)用碱性磷酸酶切除DNA5'末端磷酸基

(8)末端转移酶在3′羟基末端进行同系多核苷酸的加尾。

(9)dna酶: dna切断

( 10)rna酶: rna切断

在所有的工具酶中，限制性核酶端粒酶具有特别重要的意义。 限制性内切酶是认识dna的特异性序列，在认识点或其周围切断双链dna的端粒酶。 根据酶的组成，通过切断必要的因子和dna的方法，可以将限制性内切酶分为三类。 重组dna技术常用的限制性内切酶是ⅱ类酶，大部分ⅱ类酶识别dna部位的核苷酸序列是二维旋转对称的，一般这种特殊的结构顺序称为回文结构。

以下总结限制性酶，见表。

4 .目的基因

包括应用重组dna技术的分离、获得感兴趣的基因和dna序列、获得感兴趣的基因表达产物蛋白质等。 目的dna有cdna和基因组dna两种。 cdna是体外通过逆转录合成的、与rna (一般为mrna )互补的单链dna，经过聚合反应，单链cdna进一步合成双链cdna。 基因组dna是指所有dna序列，包括一个细胞或整个生物遗传新闻。

5基因载体

或者称为克隆载体。 一点dna分子，用于“携带”感兴趣的外来dna、实现外来dna的无性繁殖、表达有意义的蛋白质。 其中，为转录插入的外源dna序列并翻译成多肽链而设计的克隆载体也被称为表达载体。 作为克隆载体的dna分子有质粒dna、噬菌体dna和病毒dna。

二、重组dna的基本原理

完美的dna克隆过程应该包括①获得目的基因，②选择和构建基因载体，③连接目的基因和载体，④将重组dna分子导入受体细胞，⑤筛选含有重组分子的受体细胞(转化子)和无性繁殖

(1)目标基因的获取

现在，取得目的基因有以下途径或由来。

1 .化学合成法:在知道某个基因的核苷酸序列的情况下，或从某个基因产物的氨基酸序列导出编码该多肽的基因的核苷酸序列，使用dna合成器根据化学合成原理合成目标基因。

2 .基因组dna :使用物理方法(剪切或超声波)或限制性内切酶将染色体dna切割成多个片段，使它们与合适的克隆载体结合，将重组dna导入受体菌进行扩增，在各个细菌内重组dna成分。 细菌拥有的各种染色体dna片段涵盖了基因组的所有新闻，即基因库。 建立基因库后，结合适当的筛选方法，从许多转化株中选出含有某种基因的菌株，扩增分离得到目标基因。

. cdna :以mrna为模板，用逆转录酶合成与mrna互补的dna，复制到双链cdna片段，与合适的载体连接转移到受体菌中，扩增到cdna文库中。 可以用合适的方法从cdna文库中分离出目标基因。

4 .聚合酶链反应:当模板dna、引物及dntp存在时，在dna合成系统中引入热稳定的taq dna聚合酶。 反应体系通过改性、退火和放大循环自动化。 重复感兴趣的dna片段的酶合成，使目的基因指数性增加。

(2)克隆载体的选择与改建

1 .质粒:存在于细菌染色体外，是小型封闭的环状双链dna分子，可以独立自主复制，包括筛选标记，在含有多种限制性酶的单一切断部位，插入目的基因。

2 .噬菌体: eg λ噬菌体，mb载体

3 .质粒和酵母人工染色体载体:用于插入大的dna片段。

4 .病毒载体。

(3)外源基因与载体的连接

dna的体外重建。 这个dna重组是用dna酶把外来dna和载体共价键合而成的。

1 .粘性末端连接

(1)同一限制性酶切断部位连接由同一限制性酶切断的不同dna片段具有完全相同的末端。 那么，这样的2个dna片段一起退火后，在粘性末端的单链间进行碱基对，然后通过dna结合酶的催化作用形成共价键的重组dna分子。

(2)不同的限制性酶切断部位可以连接被两种不同限制性酶切断的dna片段，具有同一种粘性末端，即对方末端，进行粘性不同的末端连接。

2 .扁平连接

3 .同伦加尾连接

均聚物附加连接利用多聚物a和多聚物t间的退火作用等均聚物序列完成连接。 通过末端转移酶，在dna片段中生成粘性末端，然后进行粘性末端连接。

4 .人工接头连接

(四)重组dna导入受体细胞

根据dna重组中使用的载体的性质，导入重组dna分子有转化、转染、感染等不同手段。

1 .受体细胞。 用cacl2解决等一定方法解决后，具有接收外部dna能力的大肠菌。 受体菌是安全无毒菌株，应该是限制性酶缺陷型及重组缺陷型。

2 .转化、转染及感染。 本定义不涉及真核细胞，只比较大肠杆菌。

转化:以质粒为载体，将具有外源基因的载体dna导入受体细胞。

转染:以噬菌体为载体，用dna连接酶使噬菌体dna环化，通过质粒转化法导入受体菌。

感染:以噬菌体为载体，体外将噬菌体dna包装成病毒粒子，感染受体菌。

(5)重组体的筛选

1 .直接选择法

直接法是携带有载体的一个或几个标记基因和目的基因进行设计筛选法，其优点是直接测定基因表型。

(1)耐药标记的选择:如果克隆载体具有耐药标记基因，只有含有该耐药基因的转化细菌才能存活在含有该抗菌药物的培养板上，形成菌落。

(2)标记修复:如果克隆的基因可以在宿主菌中表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，可以用营养变异菌株进行筛选，这就是标记修复筛选。

(3)分子杂交法

2 .免疫学方法

应用特异抗体和目的基因表达产物的相互作用进行筛选是非直接选择法。 特异性强，灵敏度高，适合选择对宿主菌不提供任何标记的基因。

(6)克隆基因的表达

1 .原核表达系统

大肠杆菌是目前使用最多的原核表达系统，使用大肠杆菌表达载体，控制包括大肠杆菌在内的适当选择标记②转录，产生大量mrna的强力启动子③适当的翻译控制序列和翻译

大肠杆菌表达系统还存在缺点:①转录后的加工机制不足，因此只能表达克隆的cdna，不应该表达真核基因组DNA缺乏合适的翻译后的加工机制，因此表达的真核蛋白出现了合适的折叠和糖化修饰③

2 .真核表达系统

与原核表达系统相比，酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达系统等真核表达系统显示了较大的特征。 特别是哺乳类细胞，不仅表达真核的cdna，还表达真核基因组dna。 将表达载体导入真核细胞的过程称为转染，细胞转染常用的方法包括磷酸钙转染、deae葡聚糖介导的转染、电穿孔法、脂质体转染

三、重组dna技术与医学的关系

1疾病基因的发现

基因研究表明认知疾病分子机制的典型例子是脆性x综合征。

2迅速发展生物制药

3 dna诊断

dna诊断利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在dna水平上分析、鉴定与遗传疾病相关的基因置换、缺失或插入等变异。

4基因治疗

基因治疗是指向有功能不全的细胞补充相应功能的基因，纠正或补充基因缺陷，达到治疗的目的。

5预防遗传病

(1)产前诊断

(2)携带者测试。

(3)症状前诊断。

(4)遗传病易感性。

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来源：简阳新闻